Mastocitomes

Què és c-KIT? 
c-kit, també conegut com a CD117, és una proteïna de membrana que actua com a receptor de tipus tirosina kinasa de “stem cell factor” (SCF). La unió de SCF al receptor c-kit (present en diversos tipus cel·lulars, incloent les cèl·lules mastocíticas) indueix la fosforilació del mateix, la qual cosa desencadena una cascada de fenòmens bioquímics que regulen positivament la proliferació, supervivència i la diferenciació cel·lular.

El gen que codifica c-kit es denomina KIT.

Mutacions del gen KIT en mastocitomes
En 1999 es va descriure per primera vegada l'existència de mutacions en el gen KIT en alguns mastocitomas1,2. Concretament, es van trobar alteracions en els exons 11 i 12 en forma de petites duplicacions d'ADN, denominades “duplicacions internes en tàndem” (ITD). La conseqüència d'aquestes mutacions és la autofosforilació del receptor c-kit, sense necessitat de l'estímul del seu lligant, el SCF, la qual cosa porta a una proliferació descontrolada de les cèl·lules afectades.

Posteriorment s'han detectat mutacions en exons 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 i 15 3, 11, encara que les seves implicacions pronòstiques i terapèutiques no estan completament determinades12.

Actualment sabem que les mutacions de tipus ITD en els exons 11 i 8 són les més freqüents. Les alteracions de l’exó 11 suposen el 50% dels casos i les de l’exó 8 el 16%3.

Quina és la indicència de mutacions en mastocitomes canins?
Actualment es considera que entorn del 30-50% de neoplàsies mastocítiques de graus II i III són portadores de mutacions en el gen KIT10.

Quines implicacions pronòstiques i terapèutiques te la detecció de mutacions?
L'existència de mutacions en l’exó 11 s'associa amb un pronòstic pobre, tant en mastocitomes tractats amb cirurgia radical exclusivament com en mastocitomes tractats amb cirurgia i quimioteràpia (vinblastina i prednisnona)4, 5, 13. Concretament, existeix major risc de recurrència local o sistèmica (Odds Ràtio 5.4 i 6.1 respectivament) i major risc de mort a causa del tumor (OR 15)4.

Els inhibidors de l'activitat tirosina kinasa han demostrat ser una bona opció terapèutica per mastocitomes, especialment aquells que porten mutacions 6, 7, 8, tant si són tumors primaris com si són metàstasis9. En el treball de London (2009) la taxa de resposta a Toceranib en mastocitomes amb mutació va ser del 69% enfront del 37% en mastocitomes sense mutació6.

Quin és el fonament de la tènica?
Mitjançant la tècnica de PCR (Reacció en Cadena de la Polimerasa) s'amplifica la porció del gen KIT que amb més freqüència conté la mutació. El producte de l'amplificació es separa mitjançant electroforesi en gel. En condicions normals s'obté un producte de 132 bases que correspon a l’exó 11 normal. En el cas que existeixi mutació s'obté un segon producte de 185 bases que correspon a l’exó 11 amb duplicacions

La prova permet detectar tots els casos de mastocitomes amb mutació? 
No, la tècnica detecta exclusivament les mutacions en l’exó 11, que són les més freqüents en neoplàsies mastocítiques i que són les úniques, a més, que s'han correlacionat clarament amb valor pronòstic i terapèutic12.

No detecta les mutacions en l’exó 8 (entorn d'un 16% dels casos) ni mutacions infreqüents en altres exons per les quals, d'altra banda, manquem de dades fiables sobre el seu valor pronòstic12. Per tant, un resultat negatiu no implica necessàriament en tots els casos que no existeixi una mutació. 

Quin tipus de mostres es poden utlitzar? 
Hi ha diverses fonts que permeten l'obtenció d'ADN per realitzar la prova:

Mostres citològiques: poden remetre's extensions citològiques tenyides o sense tenyir obtingudes mitjançant punció (PAF/PAAF). Les mostres han de contenir, almenys, un 10% de cèl·lules mastocítiques perquè la prova sigui fiable. No són útils, per tant, mostres procedents de ganglis limfàtics, encara que existeixi sospita de metàstasi, o sang.

Biòpsies: realitzem la prova a partir del teixit inclòs en parafina obtingut en el processament de la biòpsia, de la qual obtenim l'ADN. En cas de remetre mostres des d'un altre laboratori, poden enviar-se seccions de 20 μm (2-5) en un eppendorf o remetre el bloc de parafina complet.

Quin és el termini de lliurament?
Entre 5 i 7 dies laborables des de la recepció de la mostra en el Laboratori.

Poden obtenir-se falsos negatius o falsos positius?
Com tota tècnica laboratorial, la prova requereix l'ocupació de controls positius. Atès que les mutacions solen afectar a un sol cromosoma, el propi teixit-cas serveix com a autocontrol positiu que valida la tècnica. Així i tot, poden obtenir-se falsos negatius en els següents casos:

  • La població cel·lular neoplàsica no arriba al 10% de la celularitat total de la mostra.
  • El material genètic de la mostra està deteriorat.

Una kinasa és un tipus d'enzim que catalitza la fosforilació d'una molècula. Una tirosina kinasa afegeix grups fosfat exclusivament a l'aminoàcid tirosina.


Referencias: 
1. London CA, Galli SJ, Yuuki T, et al. Spontaneous canine mast cell tumors express tandem duplications in the proto-oncogene c-kit. Exp Hematol 1999; 27:689–97.
2. Ma Y, Longley BJ, Wang X, et al. Clustering of activating mutations in c-KIT’s juxtamembrane coding region in canine mast cell neoplasms. J Inv Dermatol 1999; 112:165–70.
3. Letard S, Yang Y, Hanssens K, et al. Gain-of-function mutations in the extracellular domain of KIT are common in canine mast cell tumors. Mol Cancer Res 2008; 6: 1137–45.
4. Webster JD, Yuzbasiyan-Gurkan V, Kaneene JB, et al. The role of c-KIT in tumorigenesis: evaluation in canine cutaneous mast cell tumors. Neoplasia (New York) 2006; 8: 104–11.
5. Webster JD, Yuzbasiyan-Gurkan V, Thamm DH, et al. Evaluation of prognostic markers for canine mast cell tumors treated with vinblastine and prednisone. BMC Vet Res 2008; 4:32.
6. London CA, Malpas PB, Wood-Follis SL, et al. Multi-center, placebo-controlled, double-blind, randomized study of oral toceranib phosphate (SU11654), a receptor tyrosine kinase inhibitor, for the treatment of dogs with recurrent (either local or distant) mast cell tumor following surgical excision. Clin Canc Res 2009;15:3856–65.
7. Isotani,  M.,  Ishida,  N.,  Tominaga,  M.,  Tamura,  K.,  Yagihara, H.,  Ochi,  S.,  Kato,  R.,  Kobayashi,  T.,  Fujita,  M.,  Fujino,  Y., Setoguchi, A., Ono, K., Washizu, T. and Bonkobara, M. 2008. Effect of tyrosine kinase inhibition by imatinib mesylate on mast cell tumors in dogs. J. Vet. Intern. Med. 22: 985–988.
8. Kobayashi,  M.,  Sugisaki,  O.,  Ishii,  N.,  Yamada,  O.,  Ito,  K., Kuroki,  S.,  Sasaki,  Y.,  Ono,  K.,  Washizu,  T.  and  Bonkobara, M.  2012.  Canine  intestinal  mast  cell  tumor  with  c-kit  exon  8 mutation responsive to imatinib therapy. Vet. J. 193: 264–267.
9. Marconato L, Zorzan E, Giantin M, Di Palma S, Cancedda S, Dacasto M. Concordance of c-kit mutational status in matched primary and metastatic cutaneous canine mast cell tumors at baseline. J Vet Intern Med. 2014; 28(2):547-53.
10. Downing S, Chien MB, Kass PH, Moore PE, London CA. Prevalence and importance of internal tandem duplications in exons 11 and 12 of c-kit in mast cell tumors of dogs. Am J Vet Res. 2002; 63(12):1718-23.
11. Takeuchi Y, Fujino Y, et al. Validation of the prognostic value of histopathological grading or c-kit mutation in canine cutaneous mast cell tumours: a retrospective cohort study. Vet J. 2013; 196(3):492-8.
12. Gil da Costa RM. C-kit as a prognostic and therapeutic marker in canine cutaneous mast cell tumours: From laboratory to clinic. Vet J. 2015; 205(1):5-10.
13. Zemke D, Yamini B, Yuzbasiyan-Gurkan V. Mutations in the juxtamembrane domain of c-KIT are associated with higher grade mast cell tumors in dogs. Vet Pathol. 2002; 39(5):529-35.