PARR

Echevarne Veterinària ofereix la tècnica PARR per a millorar el diagnòstic oncològic en la espècie canina i felina

Què és?

PARR (“PCR Antigen Receptor Rearrengement”) és una tècnica destinada a la detecció de clonalitat i és de gran utilitat per a la distinció entre limfomes i processos inflamatoris. Els limfomes són, per definició, expansions clonals derivades d’una sola línia cel·lular, mentre que els processos inflamatoris són policlonals.

Quan està indicada?

Fonamentalment en aquells casos en els que la morfologia i el immunofenotipatge no són conclusius. Senyalem algunes situacions en les que pot estar indicada:

  • Algunes formes de limfoma de baix grau, denominats limfomes indolents (casos de limfomes fol·liculars, limfomes de cèl·lules del mantó).
  • Identificació de limfomes intestinals, neoplàsies que amb freqüència imiten processos inflamatoris crònics. Útil també en la distinció entre limfomes tímics i timomes. 
  • Identificació de Limfocitosis cutània, probablement una forma de limfoma indolent de cèl·lula T d’aspecte histològic benigne.
  • Distinció entre leucèmies i reaccions leucemoides.

Quines mostres han de remetre’s?

La tècnica permet l’ús de teixits frescos, teixits fixats en formol, mostres en parafina (biopsies), sang, medul·la òssia i material citològic.

Quina sensibilitat i especificitat te?

CaninaLa sensibilitat de la tècnica en mostres d'espècie canina és d’un 90% i la seva especificitat és del 92%*.

FelinaLa sensibilitat de la tècnica en mostres d'espècie felina és d’un 89% i la seva especificitat és del 96%*

*Ambdós factors depenen en bona part del tipus de mostres empleades (teixit fixat o parafinat, teixit fresc), dels encebadors utilitzats, del protocol de PCR i de la resolució de la tècnica de separació del producte de la PCR.

Quin és el fonament de la tècnica?

Els limfomes són tumors hematològics causats per l’expansió clonal de limfòcits. La detecció de la clonalitat es basa en el fet que los limfòcits contenen regions d’ADN que son únics en longitud i seqüència.

Aquestes regions úniques estan majoritàriament localitzades en los gens que codifiquen per a la regió CDR3 (Complementary Determining Region 3) tant de les immunoglobulines com del receptor de cèl·lules T. CDR3 és la regió que te capacitat per a la unió a Antigen.

En les cèl·lules B, CDR3 es produeix per la recombinació dels gens V;D i J, mentre que en les cèl·lules T , la recombinació es produeix entre els gens V i J. Durant el procés de recombinació, s’afegeixen de 5 a 20 nucleòtids a l’atzar donant lloc a la diversitat de seqüències i longitud.

Després de l’obtenció del material genètic de la mostra es procedeix a la amplificació per PCR mitjançant encebadors específics de la regió VDJ (per a les immunoglobulines) i VJ (pel TCR). La detecció dels productes amplificats es realitza mitjançant l’anàlisi de fragments emprant un seqüenciador automàtic. En cas de policlonalitat s’obté una barreja heterogènia de cadenes de diferent longitud mentre que en cas de monoclonalitat s’obté un solo pic corresponent a un tipus únic de cadenes.


La configuració del loci genètic per les immunoglobulines conté 80 gens V, 6 gens D i entre 3 i 5 gens J.

Durant el desenvolupament de les cèl•lules T i B, per mecanismes de escissió, s’ajunten una regió V i una D. En aquest procés poden afegir-se o eliminar-se nucleòtids en un nombre que varia d’una cèl•lula a l’altre, el que fa que cada cèl•lula sigui diferent de les demés.

El mateix procés es repeteix amb els gens D i J. Com resultat tenim contigüitat entre els gens V, D i J i una longitud de cadena diferent per a cada cèl·lula degut a la variabilitat en l’adició o eliminació de nucleòtids. Quan la cèl·lula es divideix, la seva descendència hereta la mateixa configuració VDJ que la seva progenitora. Per a dur a terme la tècnica, s’aïlla el material genètic de la mostra. Mitjançant l’ús d’encebadors s’amplifica la regió VDJ:

  • En cas de clonalitat s’obtenen sempre cadenes bessones:


  • En cas de policlonalitat s’obté una barreja heterogènia de cadenes de diferent longitud:

La lectura de les diferents longituds es tradueix en una gràfica:

REFERÈNCIES

  1. Bao Y, Guo Y, Xiao S, et al. Molecular characterization of the VH repertoire in Canis familiaris. Vet Immunol Immunopathol 2010;137:64–75.
  2. Burnett RC, Vernau W, Modiano JF, et al. Diagnosis of canine lymphoid neoplasia using clonal rearrangements of antigen receptor genes. Vet Pathol 2003;40:32–41.
  3. Burnett, R.C., W. Vernau, J.F. Modiano, C.S. Olver, P.F. Moore and A.C. Avery, Diagnosis of canine lymphoid neoplasia using clonal rearrangements of antigen receptor genes. Veterinary Pathology, 2003. 40: p. 32-41.
  4. Chaubert P, Baur Chaubert AS, Sattler U, et al. Improved polymerase chain reactionbased method to detect early-stage epitheliotropic T-cell lymphoma (mycosis fungoides) in formalin-fixed, paraffin-embedded skin biopsy specimens of the dog. J Vet Diagn Invest 2010;22:20–9.
  5. Keller RL, Avery AC, Burnett RC, et al. Detection of neoplastic lymphocytes in peripheral blood of dogs with lymphoma by polymerase chain reaction for antigen receptor gene rearrangement. Vet Clin Pathol 2004;33:145–9.
  6. Lana SE, Jackson TL, Burnett RC, et al. Utility of polymerase chain reaction for analysis of antigen receptor rearrangement in staging and predicting prognosis in dogs with lymphoma. J Vet Intern Med 2006;20:329–34.
  7. Moore PF, Woo JC, Vernau W, et al. Characterization of feline T cell receptor gamma (TCRG) variable region genes for the molecular diagnosis of feline intestinal T cell lymphoma. Vet Immunol Immunopathol 2005;106:167–78.
  8. Moore, P.F., J.C. Woo, W. Vernau, S. Kosten and P.S. Graham, Characterization of feline T cell receptor gamma (TCRG) variable region genes for the molecular diagnosis of feline intestinal T cell lymphoma. Veterinary Immunology & Immunopathology, 2005. 106(3-4): p. 167-178.
  9. Tamura K, Yagihara H, Isotani M, et al. Development of the polymerase chain reaction assay based on the canine genome database for detection of monoclonality in B cell lymphoma. Vet Immunol Immunopath 2006;115:163–7.
  10. Vernau W, Moore PF. An immunophenotypic study of canine leukemias and preliminary assessment of clonality by polymerase chain reaction. Vet Immunol Immunopathol 1999;69:145–64.
  11. Weiss AT, Klopfleisch R, Gruber AD. T-cell receptor gamma chain variable and joining region genes of subgroup 1 are clonally rearranged in feline B- and T-cell lymphoma. J Comp Pathol 2011;144:123–34.
  12. Werner, J.A., J.C. Woo, W. Vernau, P.S. Graham, R.A. Grahn, L.A. Lyons and P.F. Moore, Characterization of feline immunoglobulin heavy chain variable region genes for the molecular diagnosis of B-cell neoplasia. Veterinary Pathology, 2005. 42(5): p. 596-607.
  13. Yagihara H, Tamura K, Isotania M, et al. Genomic organization of the T-cell receptor Ɣ gene and PCR detection of its clonal rearrangement in canine T-cell lymphoma/leukemia. Vet Immunol Immunopathol 2007;115:375–82.
  14. Yamazaki J, Baba K, Goto-Koshino Y, et al. Quantitative assessment of minimal residual disease (MRD) in canine lymphoma by using real-time polymerase chain reaction. Vet Immunol Immunopathol  2008;126:321–31.