Mastocitomas

¿Qué es el c-KIT? 
c-KIT, también conocido como CD117, es una proteína de membrana que actúa como receptor de tipo  tirosina kinasa  de “stem cell factor” (SCF). La unión de SCF al receptor c-kit (presente en varios tipos celulares, incluyendo las células mastocíticas) induce la fosforilación del mismo, lo cual desencadena una cascada de fenómenos bioquímicos que regulan positivamente la proliferación, supervivencia y la diferenciación celular.

El gen que codifica c-kit se denomina KIT.

Mutaciones del gen KIT en mastocitomas
En 1999 se describió por primera vez la existencia de mutaciones en el gen KIT en algunos mastocitomas1,2. Concretamente, se hallaron alteraciones en los exones 11 y 12 en forma de pequeñas duplicaciones de ADN, denominadas “duplicaciones internas en tándem” (ITD). La consecuencia de dichas mutaciones es la autofosforilación del receptor c-kit, sin necesidad del estímulo de su ligando, el SCF, lo cual lleva a una proliferación descontrolada de las células afectadas.

Posteriormente se han detectado mutaciones en exones 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 153, 11, aunque sus implicaciones pronósticas y terapéuticas no están completamente determinadas12.

Actualmente sabemos que las mutaciones de tipo ITD en los exones 11 y 8 son las más frecuentes. Las alteraciones del exón 11 suponen el 50% de los casos y las del exón 8 el 16%3.

¿Cúal es la incidencia de mutaciones en mastocitomas caninos?
Actualmente se considera que en torno al 30-50% de neoplasias mastocíticas de grados II y III son portadoras de mutaciones en el gen KIT10.

¿Qué implicaciones pronósticas y terapéuticas tiene la detección de mutaciones?
La existencia de mutaciones en el exón 11 se asocia con un pronóstico pobre, tanto en mastocitomas tratados con cirugía radical exclusivamente como en mastocitomas tratados con cirugía y quimioterapia (vinblastina y prednisnona)4, 5, 13. Concretamente, existe mayor riesgo de recurrencia local o sistémica (Odds Ratio 5.4 y 6.1 respectivamente) y mayor riesgo de muerte a causa del tumor (OR 15)4.

Los inhibidores de la actividad tirosina kinasa han demostrado ser una buena opción terapéutica para mastocitomas, especialmente aquellos que llevan mutaciones6, 7, 8, tanto si son tumores primarios como si son metástasis9. En el trabajo de London (2009) la tasa de respuesta a Toceranib en mastocitomas con mutación fue del 69% frente al 37% en mastocitomas sin mutación6.

¿Cuál es el fundamento de la técnica?
Mediante la técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) se amplifica la porción del gen KIT que con más frecuencia contiene la mutación. El producto de la amplificación se separa mediante electroforesis en gel. En condiciones normales se obtiene un producto de 132 bases que corresponde al exón 11 normal. En el caso de que exista mutación se obtiene un segundo producto de 185 bases que corresponde al exón 11 con duplicaciones.

¿La prueba permite detectar todos los casos de mastocitomas con mutación? 
No, la técnica detecta exclusivamente las mutaciones en el exón 11, que son las más frecuentes en neoplasias mastocíticas y que son las únicas, además, que se han correlacionado claramente con valor pronóstico y terapéutico12.

No detecta las mutaciones en el exón 8 (en torno a un 16% de los casos) ni mutaciones infrecuentes en otros exones para las cuales, por otro lado, carecemos de datos fiables sobre su valor pronóstico12. Por tanto, un resultado negativo no implica necesariamente en todos los casos que no exista una mutación.

¿Qué tipo de muestras se pueden emplear?
Hay varias fuentes que permiten la obtención de ADN para realizar la prueba:

Muestras citológicas: pueden remitirse extensiones citológicas teñidas o sin teñir obtenidas mediante punción (PAF/PAAF). Las muestras deben contener, al menos, un 10% de células mastocíticas para que la prueba sea fiable. No son útiles, por tanto, muestras procedentes de ganglios linfáticos, aunque exista sospecha de metástasis, o sangre.

Biopsias: realizamos la prueba a partir del tejido incluido en parafina obtenido en el procesamiento de la biopsia, de la cual obtenemos el ADN. En caso de remitir muestras desde otro laboratorio, pueden enviarse secciones de 20 μm (2-5) en un eppendorf o remitir el bloque de parafina completo.

¿Cuál es el plazo de entrega?
Entre 5 y 7 días laborables desde la recepción de la muestra en el Laboratorio.

¿Pueden obtenerse falsos negativos o falsos positivos?
Como toda técnica laboratorial, la prueba requiere el empleo de controles positivos. Dado que las mutaciones suelen afectar a un solo cromosoma, el propio tejido-caso sirve como autocontrol positivo que valida la técnica. Aun así, pueden obtenerse falsos negativos en los siguientes casos:

  •  La población celular neoplásica no llega al 10% de la celularidad total de la muestra.
  • El material genético de la muestra está deteriorado.

Una kinasa es un tipo de enzima que cataliza la fosforilación de una molécula. Una tirosina kinasa añade grupos fosfato exclusivamente al aminoácido tirosina.


Referencias: 
1. London CA, Galli SJ, Yuuki T, et al. Spontaneous canine mast cell tumors express tandem duplications in the proto-oncogene c-kit. Exp Hematol 1999; 27:689–97.
2. Ma Y, Longley BJ, Wang X, et al. Clustering of activating mutations in c-KIT’s juxtamembrane coding region in canine mast cell neoplasms. J Inv Dermatol 1999; 112:165–70.
3. Letard S, Yang Y, Hanssens K, et al. Gain-of-function mutations in the extracellular domain of KIT are common in canine mast cell tumors. Mol Cancer Res 2008; 6: 1137–45.
4. Webster JD, Yuzbasiyan-Gurkan V, Kaneene JB, et al. The role of c-KIT in tumorigenesis: evaluation in canine cutaneous mast cell tumors. Neoplasia (New York) 2006; 8: 104–11.
5. Webster JD, Yuzbasiyan-Gurkan V, Thamm DH, et al. Evaluation of prognostic markers for canine mast cell tumors treated with vinblastine and prednisone. BMC Vet Res 2008; 4:32.
6. London CA, Malpas PB, Wood-Follis SL, et al. Multi-center, placebo-controlled, double-blind, randomized study of oral toceranib phosphate (SU11654), a receptor tyrosine kinase inhibitor, for the treatment of dogs with recurrent (either local or distant) mast cell tumor following surgical excision. Clin Canc Res 2009;15:3856–65.
7. Isotani,  M.,  Ishida,  N.,  Tominaga,  M.,  Tamura,  K.,  Yagihara, H.,  Ochi,  S.,  Kato,  R.,  Kobayashi,  T.,  Fujita,  M.,  Fujino,  Y., Setoguchi, A., Ono, K., Washizu, T. and Bonkobara, M. 2008. Effect of tyrosine kinase inhibition by imatinib mesylate on mast cell tumors in dogs. J. Vet. Intern. Med. 22: 985–988.
8. Kobayashi,  M.,  Sugisaki,  O.,  Ishii,  N.,  Yamada,  O.,  Ito,  K., Kuroki,  S.,  Sasaki,  Y.,  Ono,  K.,  Washizu,  T.  and  Bonkobara, M.  2012.  Canine  intestinal  mast  cell  tumor  with  c-kit  exon  8 mutation responsive to imatinib therapy. Vet. J. 193: 264–267.
9. Marconato L, Zorzan E, Giantin M, Di Palma S, Cancedda S, Dacasto M. Concordance of c-kit mutational status in matched primary and metastatic cutaneous canine mast cell tumors at baseline. J Vet Intern Med. 2014; 28(2):547-53.
10. Downing S, Chien MB, Kass PH, Moore PE, London CA. Prevalence and importance of internal tandem duplications in exons 11 and 12 of c-kit in mast cell tumors of dogs. Am J Vet Res. 2002; 63(12):1718-23.
11. Takeuchi Y, Fujino Y, et al. Validation of the prognostic value of histopathological grading or c-kit mutation in canine cutaneous mast cell tumours: a retrospective cohort study. Vet J. 2013; 196(3):492-8.
12. Gil da Costa RM. C-kit as a prognostic and therapeutic marker in canine cutaneous mast cell tumours: From laboratory to clinic. Vet J. 2015; 205(1):5-10.
13. Zemke D, Yamini B, Yuzbasiyan-Gurkan V. Mutations in the juxtamembrane domain of c-KIT are associated with higher grade mast cell tumors in dogs. Vet Pathol. 2002; 39(5):529-35.